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新冠状病毒实验室检测技术汇总

更新时间:2020-07-12 07:26点击:

  冠状病毒分布在全世界多个国家和地区,均已发现冠状病毒的存在。目前人类尚未研制出治疗2019新型冠状病毒肺炎的特效药物,新型冠状病毒肺炎患者主要是对症治疗,依赖自身免疫力清除病毒,给人类的健康造成了巨大的威胁。

  冠状病毒呈圆形或类圆形,直径为80~160 nm,具有多形性,有包膜,在电子显微镜下发现病毒的包膜上有排列间隔较宽的刺突,类似于日冕,故命名为冠状病毒[1]。冠状病毒膜表面有刺突糖蛋白(spike protein,S)、跨膜糖蛋白(membrane protein,M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N),部分病毒还有具有血凝活性的糖蛋白(haemaglutinin-esterase,HE)或包膜蛋白(envelope protein,E),其中S蛋白位于病毒的表面形成棒状结构,是病毒的主要抗原蛋白之一,在决定病毒的毒力和组织亲嗜性等方面中起重要作用[2,3]。冠状病毒的抵抗力较弱,对紫外线%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒[4]。

  国际病毒学分类委员会根据基因组的结构特点将冠状病毒分为α、β、γ和δ 4个属,其中α属冠状病毒主要由哺乳动物冠状病毒组成,包括α属冠状病毒1、人冠状病毒229E(human coronavirus 229E,HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(human coronavirus NL63,HCoV-NL63)和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)等8个种;β属冠状病毒主要由哺乳动物冠状病毒组成,包括β冠状病毒1、人冠状病毒HKU1、鼠冠状病毒、家蝠冠状病毒HKU5、果蝠冠状病毒HKU9、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndromes,SARS)相关病毒等7个种,对人类的危害最大;γ属冠状病毒主要包括鸟类冠状病毒,包含白鲸冠状病毒SW1和禽冠状病毒两个种,其中禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡传染性支气管炎在鸡群中具有高度传染性,是重要的呼吸道疾病之一,对家禽的养殖业危害很大;δ属冠状病毒既含有哺乳动物冠状病毒,也含有鸟类冠状病毒[1,5]。迄今为止,已经有HCoV-229E,HCoV-NL63、人冠状病毒OC43(human coronavirus OC43)、人类冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndromes coronavirus,SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、2019新型冠状病毒7种冠状病毒感染人类[6]。

  重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndromes,SARS,又称为非典型性肺炎)是在2002年由于冠状病毒感染而暴发全球的急性呼吸性传染病,世界卫生组织将引起此次疫情的病原体命名为SARS-CoV,2003年6月底疫情结束[7]。SARS是由SARS-CoV感染引起的以发热和肺部感染为主要特征的人畜共患病,起病急、病情发展迅速、传染性强、死亡率高,主要通过飞沫传播和与患者密切接触进行传播[7,8]。目前研究认为蝙蝠可能是SARS-CoV的自然宿主,此次疫情是进入21世纪以来全人类面临的第一个重大公共安全问题[9]。

  中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)是在2012年由MERS-CoV感染引起的呼吸道疾病,世界卫生组织将该病原体命名为MERS-CoV,2015年8月全球疫情结束[10]。MERS是由MERS-CoV感染引起的中东流行病,主要表现为急性呼吸道感染,严重者可出现急性呼吸窘迫综合征或多器官功能衰竭[11]。目前研究认为单峰骆驼是MERS-CoV的一大宿主,蝙蝠也可能是MERS-CoV的宿主之一,但是具体的传播途径尚不明确,现在大约27个国家已发现MERS-CoV感染,对人类的生命安全造成了威胁[12,13]。

  自2019年12月起,我国武汉市部分医院出现了多例不明原因的肺炎患者,患者多有华南海鲜批发市场暴露史,而且出现了发热、乏力、干咳、气促等症状,经研究证实是由2019新型冠状病毒感染引起的以肺部病变为主的新型急性传染病[14]。国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2,世界卫生组织将新型冠状病毒肺炎命名为COVID-19。最近有关蝙蝠相关冠状病毒和SARS-CoV-2的基因组研究的系统发育数据表明,蝙蝠一般是冠状病毒的天然宿主,而据推测,中国马蹄蝠是SARS-CoV-2的宿主[15]。国家卫生健康委员会将2019新型冠状病毒感染的肺炎纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病,采取甲类传染病的预防、控制措施[4]。2019新型冠状病毒感染可引起以肺炎为主的一系列病变的发生,可在人与人之间传播,严重危害公共健康,并给人们造成恐慌。

  2019新型冠状病毒是一种新的β冠状病毒,其基因序列与SARS-CoV至少有85%的相似性,也是本世纪第三种人畜共患冠状病毒[7,16]。Ren等[17]通过对中国湖北省武汉市金银潭医院5例重症肺炎患者的支气管肺泡灌洗标本提取核酸进行二代测序,得到5个全基因组序列的核苷酸的相似性为99.8%~99.9%,基因组全长为29 870 bp,GC含量为37.99%~38.02%,包含两端非翻译区(untranslated region,UTR)基因和一个完整的开放阅读框基因(open reading frame gene,ORF)。研究表明,不同患者的2019新型冠状病毒序列几乎相同,序列相似性达到99.9%,便于在短时间内进行检测[3,18]。但是2019新型冠状病毒的突变速度快,每个复制周期都会发生突变,需要时刻监测病毒的突变情况[16]。

  2019新型冠状病毒与宿主细胞表面的受体结合,产生膜融合反应,进入宿主细胞寄生并以复制方式增殖。目前已经发现的人类冠状病毒受体有血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)、氨基肽酶N(aminopeptidase N, APN)和二肽基肽酶4(dipeptide peptidase 4,DPP4)3种,其中ACE2属于Ⅰ型跨膜糖蛋白,是SARS-CoV的受体,广泛分布于人体的肾脏、心脏、小肠及肺组织中;APN又称CD13,属于Ⅱ型跨膜糖蛋白,主要分布在肠道、呼吸道和肾脏上皮细胞表面,具有种属特异性;DPP4又称为CD26,属于Ⅱ型跨膜糖蛋白,是MERS-CoV的受体,主要在支气管上皮细胞和肺组织细胞中表达[19]。Lu等[16]研究的分子模型显示了SARS-CoV受体结合区和2019新型冠状病毒受体结合区之间的结构相似性,并认为2019新型冠状病毒可能使用ACE2作为受体。Zhou等[20]通过病毒传染性研究确定了2019新型冠状病毒进入细胞的受体是ACE2,还证明了2019新型冠状病毒不使用氨基肽酶N和二肽基肽酶4受体。研究表明,2019新型冠状病毒通过S蛋白与ACE2受体结合,感染人的呼吸道上皮细胞,给公共卫生健康带来了巨大的威胁[19,21]。

  2019新型冠状病毒潜伏期约为1~14 d[22]。传染源主要是新型冠状毒感染的患者,无症状感染者也可能成为传染源。呼吸道飞沫和密切接触传播为主要的传播途径,在相对封闭环境长时间暴露于高浓度气溶胶的情况下存在气溶胶传播可能[22,23,24]。同时,Zhang等[25]通过对16例患者在感染当天和第5天分别对其口咽拭子和肛拭子和血清学检测发现,感染早期口咽拭子的阳性检出率更多,后期的肛拭子阳性检出率更高,在口咽拭子、肛拭子和血液中检测到病毒,因此感染的患者可能通过呼吸、粪便-口腔或体液途径排出这种病原体。各个年龄段均普遍易感,自身有基础疾病或体质差的人更易被感染,而且容易出现家族聚集性病例[26]。

  新型冠状病毒肺炎的症状是非特异性的,以发热、乏力、干咳为主要的临床表现,发热为典型症状,上呼吸道症状(如:喷嚏或咽喉痛)比较少见,重症患者表现为病毒性肺炎症状,包括发烧、呼吸困难及双肺浸润,若发生急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),需要接受重症加强护理病房(intensive care unit,ICU)治疗和氧疗[27,28]。ICU患者胸部CT典型表现为双侧多叶及亚节段实变区[27]。患者的预后与年龄和患者的自身情况有关,老年人或是有慢性疾病的患者预后较差,儿童症状较轻,年轻人预后较好[4,26]。

  发病早期外周血白细胞总数正常或减低,淋巴细胞计数减少,部分患者可出现肝酶、乳酸脱氢酶、肌酶和肌红蛋白增高;部分危重者可见肌钙蛋白增高。多数患者C反应蛋白和血沉升高,降钙素原正常,严重者D-二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少。重型、危重型患者常有炎症因子升高[24,29]。

  RT-PCR技术:该技术结合了DNA探针杂交技术和RT-PCR技术两种优势,明显提高了检测2019新型冠状病毒的特异度和敏感度[30]。取血液标本或咽拭子、痰液等其他呼吸道样本通过进行实时荧光RT-PCR技术检测2019新型冠状病毒核酸阳性,排除了样品质量、采样时间、污染和技术问题,可作为新型冠状病毒肺炎疑似病患的确诊的病原学证据之一[4,31]。然而,实验室检测前后会有许多原因导致核酸检测结果出现假阴性,如:试剂紧急上市带来的产品质量问题;采集标本的部位、类型的不同以及标本采集规范的问题;对病毒基因组的研究较少,缺乏大数据支持;样本的运输和保存过程中核酸发生降解难以保存等因素都会对检测结果造成影响[32,33]。由于多例核酸检测出现了假阴性结果,致使有些临床医生提出了用CT替代核酸检测的观点。由于2019新型冠状病毒感染机体后,最先能被检测到的标志物是病毒的RNA,而CT检测必须在肺部发生器质性病变时才能在影像学上呈现异常,不适合用于疾病的早期诊断和疫情的紧急防控,但却是临床辅助诊断的有力补充[32]。

  值得一提的是,目前上市的核酸检测试剂均为定性试剂盒,不同试剂的最低检测下限不同,检测结果如低于这个最低检测下限,则应为未检出,和真正意义上病毒阴性的概念并非相同。新型冠状病毒肺炎患者核酸未检出可能原因,可从以下几个方面考虑:(1)样本原因:口咽等部位的呼吸道样本的采集时间、位置、采样量不当;标本保存、运输温度、时间及介质不当;(2)患者原因:患者自身病毒量未达到试剂盒最低检测下限;(3)试剂盒原因:无法检测变异病毒;最低检测下限过高;灵敏度不高;内部质控品质量不好等;(4)操作原因:核酸提取、加样量、体系建立、室内质控实施不规范。

  NGS技术:可用于病原体未知的情况下进行检测,不需要病毒的分离培养,只需要扩增样本中的所有的核酸序列,即可以检测出病原体,还可以跟踪检测病毒是否发生突变[34]。疑似病例具备呼吸道标本或血液标本病毒基因测序与已知的2019新型冠状病毒高度同源可作为新型冠状病毒肺炎疑似病患的确诊的病原学证据之一[4]。该技术有灵敏度高、准确性高、测序速度快、高通量等优点,但它对标本的要求较严格、基因数据库的数据不完善、技术本身有缺陷以及技术之外的问题都尚待解决[9]。

  病毒的分离培养是实验室诊断的金标准,疫苗和抗病毒药物的研发等研究也需要进行病毒分离培养技术[35]。由于2019新型冠状病毒常规培养需要6 d,培养周期较长,生物安全等级要求较高,分离阳性率不高等因素,尚未应用于临床[30,36]。

  目前2019新型冠状病毒的血清学检测产品主要包括化学发光法、胶体金法和酶联免疫吸附测定,可检测病毒的抗原和抗体。其中,IgM抗体用于2019新型冠状病毒的潜伏期或急性期监测,IgG抗体可用于病程初期和恢复期监测。由于血清学抗体检测会存在窗口期,不适合用于2019新型冠状病毒的早期诊断,可用于辅助筛查[37]。截至2020年2月25日,国家药监局已批准2种胶体金方法抗体检测试剂注册,在扩大2019新型冠状病毒检测方法和手段的同时,或可有效缩短实验室确诊时间。

  2019新型冠状病毒感染对人类的工作和生活产生了极大的不良影响,随着疾病相关研究的不断深入,实验室检测项目及其临床意义也将逐步完善。在疾病诊疗过程中还需结合实验室结果、影像学结果和临床表现综合评价,以达到早发现、早诊断、早治疗的预防效果。


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